过表达GATA-4骨髓间充质干细胞以外泌体修复心肌损伤的相关microRNA

背景:GATA-4是与心脏发育特异相关的锌指样转录因子,前期实验发现过表达GATA-4的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分泌的外泌体(exosome)与BMSCs共培养时可以促使BMSCs表达出更多的心肌特异性抗原。当其与心肌细胞在低氧环境下培养可以抑制心肌细胞的凋亡。目的:探讨过表达GATA-4的BMSCs分泌exosome修复心肌损伤的相关microRNA,从分子水平对其生物学效应进行探讨。方法:(1)通过慢病毒载体GV308携带GATA-4转染小鼠BMSCs,构建过表达GATA-4小鼠BMSCs,并加入基因开启剂强力霉素,然后采用ExoQuick-TC法提取分泌的exosome;(2)实验设5组:GATA-4-BMSCs-exosome+BMSCs共培养组、空载体-BMSCs-exosome+BMSCs共培养组、BMSCs-exosome+BMSCs共培养组、BMSCs单独培养组、心肌细胞单独培养组。培养24 h采用Q-PCR定量检测心肌特异性抗原cTnT、α-actin、connexin 43、Desmin的表达;(3)实验设5组:GATA-4-BMSCs-exosome+心肌细胞共培养组、空载体-BMSCs-exosome+心肌细胞共培养组、BMSCs-exosome+心肌细胞共培养组、心肌细胞单独培养组,在低氧(体积分数为1%)无血清培养条件下培养24 h诱导细胞凋亡。以正常条件下单独培养的心肌细胞作为阴性对照组,采用流式细胞技术检测各组细胞的凋亡率;(4)采用Agilent microRNA芯片检测过表达GATA-4小鼠BMSCs分泌exosome内有关细胞分化及抗凋亡的microRNA。结果与结论:(1)Q-PCR和流式细胞技术检测结果显示:过表达GATA-4-BMSCs分泌的exosome可以有效促进BMSCs向心肌细胞转化且具有极强的抗凋亡能力;(2)Agilent microRNA芯片检测结果显示:涉及细胞分化的关键microRNA:mmu-miR-199a-3p(microRNA为上调);mmu-miR-1894-5p(microRNA为下调)。涉及细胞抗凋亡的关键microRNA:mmu-miR-199a-3p、mmu-miR-20a-5p、mmu-miR-330-3p,这3个基因均为上调。其中mmu-miR-199a-3p即涉及细胞分化又涉及细胞抗凋亡,为重点首先需要验证的microRNA。